【Nat Med |AAV基因治疗，助力长期戒酒！】据统计，全球有近三亿人患有酒精使用障碍（AUD），他们通常会经历反复的戒酒周期，然后再复发，即使使用FDA批准的戒酒药物也是如此。
脑网络中调节动机行为的神经适应是慢性、间歇性酒精暴露的结果，这种神经适应的变化被认为是AUD发生的根本原因。随着AUD的发展，会导致中脑边缘腹侧被盖区（VTA）神经元的神经递质多巴胺（DA）的释放，包括DA释放水平降低，DA受体自身敏感性降低和DA再摄取增加。这种“低多巴胺能”状态会迫使他们在戒酒一段时间后重新开始饮酒，目前还没有治疗方法或药物能够靶向这一通路。
近日，来自美国俄亥俄州立大学等高校的研究人员在《Nature Medicine》上发表了题为：“GDNF gene therapy for alcohol use disorder in male non-human primates”的研究论文。该研究通过将编码人神经胶质源性神经营养因子(一种增强多巴胺能神经元功能的生长因子)的腺相关病毒血清2型载体(AAV2-hGDNF)注入4只雄性恒河猴的VTA，GDNF的表达在12个月的反复戒酒-重新引入酒精挑战期间消除了饮酒行为的恢复。这种行为改变伴随着伏隔核多巴胺信号的神经生理调节，这种调节抵消了与慢性酒精使用相关的低多巴胺能信号状态，表明边缘回路的治疗性调节抵消了酒精的影响。这些临床前研究结果表明，针对复发预防的基因治疗可能是AUD的潜在治疗策略。
无法保持戒酒和无法减少有害的饮酒模式是目前治疗AUD患者的两个主要挑战。为了模拟这种行为，研究人员采用了一种成熟的方案来诱导和维持雄性猕猴的酒精消耗，包括每天醉酒的多个周期，然后戒酒(图1a)。酒精是通过每天递增剂量的乙醇自我给药引入的，随后是6个月的开放获取基线(OAB)期，在此期间，受试者每天可以获得水和乙醇溶液(4% w/v)22小时。两两比较显示，在整个OAB期间，平均每日酒精摄入量增加(图1b)(F4.80, 33.11=2.62,P≤0.05)。在为期6个月的OAB期间，平均酒精摄入量为每天2.27±0.28g kg-1，在OAB的最后一周，酒精摄入量稳定在每天2.49±0.09g kg-1(图1c)，相当于一个普通人每天喝9杯，且血液采样时间相对应的酒精摄入量与整个OAB期间收集的血液乙醇浓度(BEC)显著相关(图1d;r=0.941;P≤0.0001)。在OAB的最后一周，每个受试者消耗的酒精量是稳定的，但受试者之间存在差异(图1c,e)。根据这些数据确定未来的治疗组，并通过OAB最后一周的总体平均酒精摄入量来平衡。此外，对照组和GDNF组的最大平均值分别为2.47±0.28和2.51±0.49(图1e中的虚线)，两组之间没有显著差异，BEC与酒精摄入量之间也没有正相关。
在OAB期结束时，用水代替乙醇(即强制戒酒)4周，然后手术输注治疗药物(图2)。在非人类灵长类动物(NHPs)恒河猴的双侧注射AAV2-hGDNF(2.0x10^13vg ml−1)或通过成像引导对流增强输送含钆的对照至VTA(MR-guided CED)(图2)。在病毒输注后持续禁欲2个月，以获得最佳的病毒转导和蛋白表达(A1期;图1a)，然后重新引入酒精，持续4周(第R1阶段，图1a)。共有六个强制戒断/酒精恢复阶段被重复，以模拟从AUD患者观察到的戒断/恢复饮酒周期(图1a)。在戒酒/饮酒-恢复周期中，AAV2-hGDNF显著降低了再饮酒期间的酒精摄入量(F6,36=5.00,P≤0.001;图3a,b)。在整个R1期，AAV2-hGDNF治疗的受试者的BEC也降至检测不到的水平，并且在R2-R6期的大多数周内，组内仍检测不到BEC(图3c,d)。相比之下，在整个周期中，无论作为一组(图3a-d)还是单独，接受载体治疗的受试者每月和每周的酒精摄入量和BEC水平都持续升高，并且与OAB摄入量没有差异。
先前的研究表明，在恒河猴和患有AUD的患者中，戒酒后饮酒会短暂增加。因此，戒酒后第一天的乙醇可用性被单独评估，以评估危险的饮酒模式。用载体治疗的受试者继续重复他们的每次酒精重新引入发作时的OAB期饮酒常规(图3e、f)，与发作第一天的BEC升高相对应(图3d;每个R阶段显示的第一个数据点)。药物治疗的受试者在禁欲后的第一阶段也表现出最大回合大小(即R5和R6;F6,36=3.39,P≤0.01;图3f)，表明这些受试者在早期重新引入酒精时“超过”了之前的平均摄入量，与之前的研究结果一致。相反，与基线相比(F1,6=82，P≤0.0001)和对照灌胃组(F6,36=3.4,P≤0.01)比，接受AAV2-hGDNF治疗的受试者在R2-R6期戒酒后第一天出现最大酒精摄入量的时间延迟(图3e)，并且在R1-R6阶段的最大回合酒精摄入量也显著减少(F1,6=18.11，P≤0.01;图3f)。接受AAV2-hGDN治疗的受试者在第一次饮酒发作时也表现出较长的延迟(F1,6=12.05,P≤0.01)，首回合较小(F1,6=29.95,P≤0.01)，且在戒酒后的第一阶段，每公斤酒精消耗的总克数较低(F6,36=2.48,P≤0.05)。因此，对酒精的饮酒模式明显减少，但没有消除，这表明AAV2-hGDNF治疗并未引起条件性味觉厌恶。相反，治疗产生了一种新的、持久的滴定，以降低酒精摄入量。
随后，研究人员从恒河猴食物的摄入量、体重、水的摄入量以及感觉运动和动机行为方面来评估AAV2-hGDNF治疗的耐受性。首先，两个治疗组在术后(第0天)立即表现出食物维持行为的急剧、短暂性下降，术后第1周恢复到基线(图4a)。对于体重，在术后2-8周(A1期结束)，给药的猴子体重平均下降8%，然后缓慢恢复体重增加(图4b)。AAV2-hGDNF治疗的受试者在术后2-16周期间出现短暂的体重减轻，在A2期结束时OAB的最大体重减轻平均为18%(图4b)，此后逐渐回归基线。到R6期，AAV2-hGDNF受试者的体重仍比对照组基线体重和载药组体重低13%(图4b),但在整个研究过程中体重都在健康范围内。考虑到各组之间持续存在的体重差异，研究人员评估了来自乙醇的热量摄入，乙醇是一种能量密集的来源，提供7kcal g-1。研究期间，与对照组比(13.2-15.9 kcal kg-1/天)，GDNF受试者(每天0.7-1.1 kcal kg-1)每天摄入的乙醇衍生卡路里在R期显著减少(F6,30=9.40,P≤0.01;图4c)。对于水的摄入量，研究发现手术后，GDNF处理组的水和总液体摄入量比OAB略有下降，低于载体处理组(图4c、d)，但在其他研究中报道的猕猴每日饮水量范围内。相比之下，在禁食阶段，对照受试者的水和总液体摄入量比基线增加了67-88%(图4c,d)，这个结果表明与naïve对照组相比，饮酒的NHPs摄入的液体量更高。最后，在围手术期每隔1- 2周进行一次伸手任务(伸手到笼子外的葡萄干)，以评估三个阶段的感觉运动功能：伸手到葡萄干的时间(第1阶段，图4e)，抓住葡萄干的时间(第2阶段，图4f)和把葡萄干放回嘴里的时间(第3阶段，图4g)。分别对三个阶段进行评估，并将其汇总以评估完成任务的总时间(图4h)。在AAV2-hGDNF输注后的前7周，受试者到达葡萄干的时间存在差异。然而，与对照组相比，这些没有显著性区别(图4)。在A4和A6阶段，三氯蔗糖被用作动机行为的探针，发现GDNF处理的受试者再h内连续6次消耗20%的樱桃味三氯蔗糖溶液，而对照受试者消耗100%(图4i,j)
免疫组织化学显示，与对照组相比，AAV2-hGDNF治疗组脑的VTA中GDNF蛋白增加，以及伏隔核(NAc)、腹侧壳核和尾状核在内的投影区域，这是由VTA轴突分泌GDNF造成的(图4a)。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行蛋白定量，与对照组比，发现GDNF在NAc、腹侧壳核和尾状核区域的表达均显著增加(图5b)。GDNF受试者的前额叶皮层和扣带回GDNF浓度与对照组相比只有轻微但显著升高(图5b)。这一发现表明，与中边缘途径相比，通过中皮层途径的GDNF轴突运输有限。
高效液相色谱(HPLC)检测显示，AAV2-hGDNF组VTA中DA浓度比对照载体组高5.8倍(图5c)，DOPAC比对照组高26.5倍，HVA水平比对照组高3倍(图5d)，暗示DA水平的显著增加与VTA中GDNF表达相关。研究进一步发现在中边缘区和中皮质区，4名GDNF治疗的受试者中有3名NAc和尾状核的DA水平分别高于对照组。NAc、DOPAC和HVA水平分别比载药组高约3倍。尾状核、腹侧壳核和扣带回的HVA显著升高。在PFC中，DA及其代谢物的水平没有变化。在黑质中，DA水平也没有变化，但AAV2-hGDNF受试者的DOPAC和HVA水平明显高于对照(图5d,e)，目前尚不清楚这种升高是直接由于黑质中DA代谢的增加还是邻近VTA的细胞外代谢物的增加。AAV2-hGDNF处理的猴子NAc、壳核和CN的HVA/DA比率(DA利用率指标)显著高于对照(图5 f)。经对照处理的饮酒猴NAc中DA利用率显著降低(F2,17=21.6;P≤0.01)，AAV2-hGDNF处理的猴子的HVA/DA比率与naïve灵长类动物相当，这些结果表明GDNF转基因产物靶向参与奖赏回路的能量神经元。
此外，该团队通过对NAc切片进行离体快速扫描循环伏安法，研究人员使用“张力样”单脉冲刺激和“相位样”刺激序列(10个脉冲频率增加)来评估末梢受刺激DA释放的变化。单脉冲DA释放量在对照载体组、AAV2-hGDNF和基线对照组之间无统计学意义(图6 a)。然而，与AAV2-hGDNF处理动物的平均水平相比，四组中有三组的单脉冲DA释放量较低(平均=0.2898)。对照载体组和AAV2-hGDNF处理组的DA再摄取均显著低于对照组(图6 b)，但对照载体组和AAV2-hGDNF处理组之间无显著差异。进一步研究显示对照载体处理的动物表现出最低的“相样”释放，基线对照组表现出最高的释放，AAV2-hGDNF处理的动物表现出酒精介导的“相样”DA释放抑制的部分逆转(图6 c)。虽然没有显著差异，但在不同频率上，AAV2-hGDNF处理的“相位样”DA释放比载体处理的受试者高1.8-2.5倍，这表明突触前终末潜在释放的DA可用池更大。为了评估急性酒精对NAc中DA释放的急性影响，该团队使用了生理学上相关的酒精浓度并记录了单脉冲刺激。发现在对照载体的受试者中，DA的释放不受酒精的影响(图6 d)。然而，AAV2-hGDNF治疗的受试者在应对22 mm和44 mm乙醇时分别表现出30%和46%的DA释放量降低(图6 e)，提示对酒精在突触前DA末端的急性抑制作用的敏感性增加。
已知慢性酒精使DA自身受体增敏，在D2/D3 DA受体激动剂quinpirole存在时，导致DA释放受到更大的抑制。将NAc切片暴露于累积浓度的喹匹罗(30nM,100nM)中，发现AAV2-hGDNF治疗的受试者在单脉冲刺激后，与载药组相比，喹匹罗的效果降低(图6f)。由于长期暴露于酒精会增加kappa阿片受体(KOR)激动剂抑制DA释放的能力。研究人员加入累积浓度的KOR激动剂U50,488(0.3μM, 1μM)，并施加单脉冲刺激。结果观察到，AAV2-hGDNF处理和载体处理的受试者对U50,488的反应无差异(图6g)，表明GDNF没有改变KOR功能。由于NAc烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)与酒精介导的DA减少有关，以响应“相样”刺激序列，nAChR拮抗剂可以阻断体内和体外酒精介导的DA释放的急性抑制。于是研究人员检查了选择性含α4亚基的nAChR拮抗剂DHβE对单脉冲和刺激序列的DA释放的响应。发现与AAV2-hGDNF处理的受试者在无药物条件下观察到的DA的增强“相样”释放不同(图6c)，在单脉冲基线中，AAV2-hGDNF和载体处理的受试者之间没有观察到DHβE的显著差异(图6h)，但频率有主要影响。当对刺激训练的反应进行比较分析时，在应用DHβE之前，DHβE归一化到基线释放，AAV2-hGDNF和载体处理的受试者似乎“正常化”，对照载体组对刺激训练的反应增强，而AAV2-hGDNF组对刺激训练的反应减弱(图6i)，提示GDNF过表达可以调节nAChRs。
综上所述，使用基因疗法治疗中枢神经系统疾病是一个已建立并迅速扩大的领域。在恒河猴中，MR引导的AAV2载体VTA递送已被证明是安全和耐受的，并且已经安全地应用于人类患者的中脑。实质内AAV2-hGDNF传递和表达的安全性也已在NHPs中得到证实，目前在临床试验中，AAV2-hGDNF的经皮递送正在被评估为PD的治疗方法(NCT04167540, NCT01621581)。在该团队的NHPs模型中，鉴于GDNF基因治疗在减少再引入相关酒精摄入方面的深远功效，该团队相信这种治疗方法可能是一种有希望的治疗AUD的方法，并且可能对其他物质使用障碍也有效。

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